大教堂博物館收藏花之聖母教堂及喬托鐘樓、聖喬萬尼洗禮堂的藝術品。從19世紀末期開始，這些原來陳列在教堂中和室外陳列的藝術品和有重要價值的建築構件被集中安放在博物館中，以便更好地保護。由於教堂、鐘樓和洗禮堂的建造前後歷經數百年，這些藝術品和建築構件就成為完整瞭解文藝復興時期佛羅倫薩造型藝術的發展變遷的最好教材。
由一層通往二層的樓梯旁是博物館的珍寶：米開朗基羅的《聖母子》，這是他三幅同題材作品中的第二幅。
多納泰羅的木雕作品《抹大拉》（Magdalene）在二層一間展室的中央陳列。
二層還有由羅比亞和多納泰羅建造的聖歌隊席位，是從大教堂中整體搬遷到這裡的，無論從建築還是雕塑的角度來看，都是文藝復興風格的重要作品。
博物館中還收藏著從13世紀到18世紀使用的祭祀用品、洗禮堂的祭壇、喬托鐘樓的絞盤、教堂大圓頂的模型和建造工具等重要文物。